L'esterilització en autoclau implica tres etapes diferenciades:
Eliminació d'aire: en aquesta etapa inicial, l'autoclau elimina l'aire de la cambra. Una bomba de buit aspira l'aire, creant un ambient de baixa pressió. Aquest pas garanteix que el vapor pugui penetrar totes les zones amb eficàcia i arribar a la càrrega per a una esterilització adequada.
Esterilització: un cop eliminat l'aire, la temperatura a l'interior de l'autoclau arriba al nivell correcte. El vapor saturat, generat sota pressió, mata bacteris, virus i altres microorganismes. La temperatura habitual d'esterilització és de 121 graus a una pressió d'1,1 quilograms/centímetre quadrat (kg/cm²) (equivalent a 15 lliures/polzada quadrada (lb/in²)). La durada de l'autoclau varia en funció del volum de la càrrega, però generalment es considera que és de 15-20 minuts.
Refrigeració/assecat: després de l'esterilització, s'allibera el vapor i l'autoclau es refreda. Un cop la temperatura és segura, s'obre la porta i els articles esterilitzats estan preparats per al seu ús.
L'eliminació eficaç de l'aire, el posicionament adequat dels articles i el temps d'escalfament adequat són crucials per a una esterilització reeixida a l'autoclau.