Introducció al principi i aplicació dels components generals de l'espectrofotòmetre

L’espectrofotòmetre s’utilitza àmpliament en la investigació biològica, química, clínica i ambiental.
L’espectrofotometria mesura la quantitat de llum que un producte químic pot absorbir passant un feix de llum a través d’una mostra en un espectrofotòmetre.
Mesurant la intensitat de llum detectada, es pot utilitzar el mètode per determinar la concentració de solut a la mostra.
El concepte d’espectrofotometria
El feix enviat a la mostra consisteix en un feix de fotons.
Quan els fotons es troben amb les molècules de la mostra, les molècules poden absorbir-ne algunes, reduir el nombre de fotons al feix i reduir la intensitat del senyal de detecció.
La transmitància és part de la llum que passa a través de la mostra. Es defineix com la intensitat de llum que passa per la mostra a la intensitat de llum incident.
L’absorbància és contrària a la transmitància, corresponent a la quantitat mesurada per l’espectrofotòmetre.
Segons l’absorbància, la concentració de la mostra de solució es pot determinar a partir del projecte de llei de Lambert, que demostra que hi ha una relació lineal entre l’absorbància i la concentració de la mostra. Segons la llei Lambert de la cervesa, l’absorbància és el producte del coeficient d’absorció, que és una mesura de la quantitat de llum absorbida pel solut a una longitud d’ona determinada i la distància per on passa la llum. Mostra, distància de viatge i concentració de solut. En general, l’objectiu de mesurar l’absorbància és mesurar la concentració de la mostra.
Components de l'espectrofotòmetre
Cada espectrofotòmetre consisteix en una font de llum, un col·limador (lent o un dispositiu de focus per transmetre bigues fortes i rectes), un monocromador per separar feixos de diferents longituds d'ona i un selector de longitud per seleccionar l'ona o la ranura de la longitud d'ona desitjada. La longitud d’ona de la llum utilitzada en l’espectrofotòmetre presentat en aquest vídeo està en el rang de la llum ultraviolada i visible. L’espectrofotòmetre també inclou un suport de mostra, un fotodetector i una pantalla que mostra els resultats del detector.
L’espectrofotòmetre més recent s’acobla directament a un ordinador, on es poden controlar els paràmetres experimentals i mostrar els resultats.
Principi de treball de l'espectrofotòmetre
Per dur a terme espectrofotometria, és important prendre precaucions adequades, com ara portar guants, segons el tipus de solució biològica o química que utilitzeu.
Engegueu el dispositiu i deixeu que la làmpada i l’electrònica s’escalfin abans de mesurar l’espectre UV-Vis de la mostra.
Prepareu una mostra en blanc de la mateixa solució amb el mateix pH i força iònica similar, però sense que els components siguin analitzats; ja que la cubeta i el dissolvent poden dispersar la llum, cal analitzar la mostra.
El porta-mostreig d'espectrofotòmetre tradicional està dissenyat per subjectar bols de plàstic i quars. Pipeta la solució original en un bol.
Després d’esborrar les empremtes dactilars i esquitxar-les a la part exterior del bol, introduïu la cuita correctament al porta-mostra i tanqueu la porta de la tapa.
No oblideu mai tancar la porta perquè la radiació UV d’un espectrofotòmetre obert pot danyar els ulls i la pell.
Programa la longitud d’ona o l’ample de longitud d’ona que es transmetrà a la mostra. Això depèn de la millor longitud d’ona que pugui absorbir el component analitzat. La màquina es zero després mesurant la mostra en blanc, la qual cosa resta la absorbència inferior a causa del buffer de mostra.
Segons el tipus d’experiment d’espectrofotometria que feu, pot ser necessari generar una corba estàndard abans de la mesura de la mostra, a partir de la qual es pot determinar la concentració del compost analitzat a la mostra.
Deixeu que la mostra arribi a la temperatura adequada i barregeu suaument per no introduir bombolles. A continuació, es pot afegir la mostra directament al bol dins de la màquina i es pot fer una lectura.
Després de mesurar la mostra per absorbència, es calcula correctament l'experiment; per exemple, per determinar la concentració o nivell d’activitat enzimàtica.
Aplicació d’espectrofotòmetre
Un dels usos més habituals de l’espectrofotòmetre és mesurar la densitat cel·lular. El mesurament de la densitat cel·lular es pot utilitzar per produir la corba de creixement logarítmic dels bacteris, a partir del qual es pot determinar el temps òptim per a la integració de la proteïna recombinant.
L'espectrofotòmetre també es pot utilitzar per mesurar la velocitat de reacció química. En aquesta realització, l'absorbància s'utilitza per controlar la reacció enzimàtica, que desapareix amb el temps a través d'una reacció intermèdia de 452nm. La velocitat d’aquest pas enzimàtic es pot calcular coincidint les dades amb l’equació adequada.
La introducció de microespectrofotòmetre elimina la necessitat de suport de mostra. Aquests espectrofotòmetres fan servir la tensió superficial per mantenir la mostra.
El microspectrofotòmetre és la millor opció per mesurar la massa i la concentració de mostres petites i cares, com les biomolècules, incloses les proteïnes i els àcids nucleics.
L’absorbància de proteïnes a 280 nm depèn del contingut de les cadenes laterals aromàtiques que es troben en el triptòfan, la tirosina i la fenilalanina, així com l’enllaç disulfur entre les dues cisteïnes.
La concentració de proteïnes es pot determinar per la seva absorbència a 280 nm i el seu coeficient d’absorció, que es basa en la composició d’aminoàcids.
L’ADN i l’ARN tenen l’absorbància màxima a 260 nm, a partir de la qual es poden determinar les seves concentracions. La puresa dels àcids nucleics també es pot avaluar a partir de la relació entre les lectures d’absorbència i les longituds d’ona específiques.