Quantificació de proteïnes colorimètriques espectrofotomètriques
Les proteïnes solen ser una barreja de proteïnes. Els assaigs colorimètrics es basen en els constituents de proteïnes: els aminoàcids (per exemple, la tirosina, la serina) reaccionen amb un grup o colorant cromogènic addicional per produir un material de color. La concentració del material de color està directament relacionada amb la quantitat d'aminoàcids que la proteïna reacciona, reflectint així la concentració de proteïnes.
Mètode colorimètric
Hi ha diversos mètodes com BCA, Bradford i Lowry.
El mètode Lowry: Basat en la reacció Biuret més antiga i millorada. La proteïna reacciona amb Cu2 per produir una reacció blava. Tanmateix, el mètode Lowry és més sensible que Biuret. El desavantatge és la necessitat d'afegir de forma seqüencial diversos reactius diferents; la reacció triga molt de temps; és susceptible a substàncies no proteïnes; Les proteïnes que contenen EDTA, Triton x-100 i sulfat d'amoníac no són adequades per a aquest mètode.
L'assaig d'acid Bicinchoniinine: es tracta d'un assaig de proteïnes més nou i més sensible. La proteïna que s'ha d'analitzar reacciona amb Cu2 en una solució alcalina per produir Cu, que forma un quelat amb BCA per formar un compost violeta amb un pic d'absorció a 562 nm. La relació lineal entre la concentració d'aquest compost i la proteïna és forta, i el compost format després de la reacció és molt estable. Pel que fa al mètode Lowry, l'operació és senzilla i la sensibilitat és alta. No obstant això, similar al mètode Lowry, és susceptible a la interferència amb proteïnes i detergents.
El mètode de Bradford: el principi d'aquest mètode és que la proteïna reacciona amb Coomassie Brillant Blau per produir un compost de color que absorbeix a 595 nm. La seva major característica és la seva sensibilitat, que és 2 vegades superior a Lowry i BCA. És més senzill i ràpid. Només requereix un tipus de reactiu de reacció. El compost pot ser estable durant 1 hora per facilitar el resultat; Interferint amb Lowry, BCA reacciona amb agents reductors (per exemple, TDT, mercaptoetanol) compatibles. Tanmateix, encara és sensible als detergents. El principal inconvenient és que els diferents estàndards poden generar grans diferències en els resultats de la mateixa mostra i no tenen resultats comparables.
Alguns investigadors que estan exposats a medicions colorimètriques per primera vegada poden ser confosos pels resultats de les diverses proves colorimètriques. Quin tipus de mètodes creu que es confonen? A causa del fet que els grups reaccionen de diferents maneres i els grups cromogènics no són els mateixos, diversos mètodes s'utilitzen simultàniament per fer que les concentracions d'exemple de la mateixa mostra no siguin coherents. Per exemple, Keller et al. va provar la proteïna en la llet humana i va trobar que les concentracions mesurades per Lowry i BCA eren significativament superiors a les de Bradford. La diferència va ser important. Fins i tot si es determina la mateixa mostra, la mostra estàndard seleccionada pel mateix mètode colorimètric és inconsistent, i la concentració després de la prova també és inconsistent. Per exemple, utilitzeu Lowry per provar la proteïna de l'homogenat cel·lular, utilitzant BSA com a estàndard, amb una concentració d'1,34 mg / ml i una globulina com a estàndard amb una concentració de 2,64 mg / ml. Per tant, abans de seleccionar un mètode colorimètric, és preferible referir-se a la composició química de la mostra a provar i trobar una proteïna estàndard semblant químicament com a estàndard. A més, el mètode colorimètric per quantificar les proteïnes sovint causa problemes pel fet que el valor d'absorció de la mostra és massa baix, donant lloc a una gran diferència entre la concentració de mostres mesurada i la concentració real. La qüestió clau és que el color de la part important de l'espectrofotòmetre 1011, la cubeta, té una certa vida mitjana, de manera que cada mètode colorimètric llista el temps de prova de reacció. Totes les mostres (incloses les mostres estàndard) han de ser provades en aquest moment. Si el temps és massa llarg, el valor d'absorció obtingut es fa més petit i el valor de concentració convertit disminueix. A més, la temperatura de reacció, el valor de pH de la solució, etc. són factors importants que afecten l'experiment. A més, és molt important utilitzar la colorimetria plàstica. Eviteu utilitzar tauletes de quars o de vidre perquè el color després de la reacció provocarà el color de quars o de vidre, cosa que provocarà una absorbància inexacta de la mostra.
L'empresa s'especialitza en la venda d' espectrofotòmetres , clients de benvinguda que necessiten consultar i adquirir, li oferirem productes i serveis de qualitat, així com preus més baixos.
Correu electrònic: info@sumerlab.com
Web: sumerinstrument.com